A infecção hospitalar (IH) é a mais frequente complicação que ocorre em pacientes hospitalizados. A transmissão de micro-organismos em ambiente hospitalar pode ocorrer entre indivíduos ou entre materiais inanimados e indivíduos. Para sua prevenção, normas básicas de limpeza e desinfecção devem ser seguidas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade do ambiente hospitalar e da solução desinfetante empregada na limpeza e desinfecção de superfícies, verificando a presença de bactérias resistentes a antibióticos. A qualidade da solução desinfetante de hipoclorito de sódio foi determinada com emprego de métodos analíticos descritos na Farmacopeia Brasileira, 5. ed. Foram analisados 42 lotes de amostras a 1% (Grupo A) e 15 lotes cujas concentrações variaram de 10 a 12% (Grupo B). Para o teste de contagem microbiana, foram coletadas amostras de superfícies, das áreas do Centro de Terapia Intensiva, da Sala de Hemodiálise e da Enfermaria de Clínica Médica Feminina (ECMF). A susceptibilidade da bactéria frente a doze antimicrobianos (TSA) foi avaliada, segundo a técnica de difusão em ágar de Kirby & Bauer. Os resultados dos testes de dosagem da substância ativa nas amostras mostraram que 2% dos lotes do Grupo A e 67% dos lotes do Grupo B apresentaram conformidade ao limite especificado. As cargas microbianas médias foram de 24,1 unidades formadoras de colônias (ufc)/cm2 para micro-organismos aeróbios mesófilos totais e de 11,5 ufc/cm2 para fungos totais. Os resultados da contagem para uma mesma área em dias diferentes apresentaram valores discrepantes, sendo mais críticos na ECMF. Foram identificadas 20 cepas de Staphylococcus spp isoladas das três áreas avaliadas. O teste de sensibilidade mostrou a presença de micro-organismos resistentes à penicilina e eritromicina, alem de duas multirresistentes de Staphylococcus spp coagulase negativa e resistente à oxacilina. Os resultados deste estudo corroboraram a importância do monitoramento ambiental em relação à carga microbiana e da utilização de procedimentos de limpeza e desinfecção de rotina, eficazes e consensuais, com a finalidade de prevenir o surgimento da infecção hospitalar.