Comparison of two DNA obtainment methods as alternative protocols for the detection of human malaria parasites by nested PCR

Ano: 2010 | Volume: 1 | Número: 2

Autores: Giselle Maria Rachid Viana, Danielle Regina Lima Barbosa, Ediclei Lima do Carmo, José Mário Veloso Peres, José Maria Souza Nascimento, Marinete Marins Póvoa

Palavras-chave: Malaria, DNA, Polymerase Chain Reaction

Resumo Português:

Um diagnóstico laboratorial correto e preciso de malária humana ainda é considerado um desafio, pois o método de referência, o da gota espessa com colocação pelo Giemsa, apresenta limitações que dificultam o controle da malária. Devido a esses problemas, várias pesquisas têm objetivado desenvolver métodos alternativos para o diagnóstico da malária. Grande parte desses estudos aborda métodos de diagnóstico molecular, que têm acarretado o desenvolvimento de algumas alternativas ao método de coloração pelo Giemsa. No entanto, esses métodos, por sua vez, apresentam suas limitações, que incluem seu alto custo, a complexidade do protocolo e a variação da qualidade das fontes de DNA e de reagentes. Neste aspecto, a técnica de nested PCR tem demonstrado ser um bom método e pode ser melhorado usando uma fonte de DNA de alta qualidade. Neste estudo foram avaliados dois métodos para a obtenção de DNA de amostras de sangue seco colhidas em papel de filtro: 1) lavagem e 2) saponina/Chelex-100. O segundo método apresentou sensibilidade e especificidade mais altas em relação ao primeiro, pois detectou mais infecções, tanto simples como mistas, bem como infecções por Plasmodium malariae. Com base nesses resultados, apresentamos o segundo como o protocolo de escolha para a obtenção de DNA. A técnica de nested PCR usando saponina/Chelex-100 para extração de DNA pode ser um método alternativo ou complementar de diagnóstico de parasitas da malária humana, mas não é considerado adequado para o uso de rotina.

Resumo Inglês:

The correct and precise laboratory diagnosis of human malaria is still a challenge because the reference method, the Giemsa-stained thick blood smear (TS), has limitations that present problems for malaria control. Because of these problems, several studies have attempted to develop alternative methods for malaria diagnosis. Many of these studies focus on molecular diagnosis methods and have led to the development of some alternatives to TS. However, their limitations include high cost, protocol complexity and variable quality of DNA sources and reagents. Nested PCR has been shown to be a good method in this respect and it can be improved by using a high-quality source of DNA. In this study we evaluated two methods for the obtainment of DNA from dried blood samples on filter paper: 1) washing and 2) saponin/chelex-100. The second method showed higher sensitivity and specificity compared to the first, as it detected more infections, whether single or mixed, as well as Plasmodium malariae infections. Based on these results, we present this method as the protocol of choice for DNA obtainment. Nested PCR using saponin/chelex-100 for DNA extraction could be an alternative or complementary diagnosis method for human malaria parasites, but it is not appropriate for routine use.

Resumo Espanhol:

Un diagnóstico de laboratorio correcto y preciso de malaria humana todavia se considera un desafio, pues el método de referencia, el de la gota espesa con colocación en Giemsa, presenta limitaciones que dificultan el control de la malaria. Debido a esos problemas, varias investigaciones han tenido como objetivo desarrollar métodos alternativos para el diagnóstico de la malaria. Gran parte de esos estudios aborda métodos de diagnóstico molecular, que han resultado en el desarrollo de algunas alternativas al método de tenido por Giemsa. Sin embargo, esos métodos, por su vez, presentan limitaciones, que incluyen su alto costo, la complejidad del protocolo y la variación de la calidad de las fuentes de DNA y de reactivos. En este aspecto, la técnica de nested PCR ha demostrado ser un buen método y puede ser mejorado usando una fuente de DNA de alta calidad. En este estudio se evaluaron dos métodos para la obtención de DNA de muestras de sangre seca recogidas en papel de filtro: 1) lavado y 2) saponina/Chelex-100. El segundo método presentó sensibilidad y especificidad más altas en relación al primero, pues detectó más infecciones, tanto simples como mixtas, bien como infecciones por Plasmodium malariae. Con base en estos resultados, presentamos el segundo método como el protocolo de elección para la obtención de DNA. La técnica de nested PCR usando saponina/Chelex-100 para extracción de DNA puede ser un método alternativo o complementario de diagnóstico de parásitos de la malaria humana, pero no se considera adecuado para uso de rutina.