Objetivo: este estudo propõe o desenho e a validação in silico de primers para PCR quantitativo multiplex, visando à detecção rápida de genes de resistência. Métodos: as sequências de genes de resistência foram obtidas do NCBI e alinhadas no ClustalW para identificar regiões conservadas. Os primers e probes foram desenhados no OligoArchitect™ Online e avaliados pelo OligoAnalyzer da IDT para evitar estruturas secundárias. Resultados: os genes blaSHV e ermA foram selecionados como alvos, com GAPDH como controle interno. Os primers e probes apresentaram variações estruturais, com diferenças em Tm e ΔG. Algumas sequências, como ermA-F e ermA-R, mostraram valores próximos ao limite inferior de GC, enquanto blaSHV-R apresentou múltiplas formações em hairpin. A análise de multiplexação revelou interações cruzadas, com ΔG variando de -0,2 a -7,2 kcal/mol, indicando estabilidade variável. Conclusão: os primers e probes projetados apresentaram bons índices de GC, Tm e energia livre de Gibbs, sugerindo potencial para diagnóstico molecular. No entanto, testes experimentais são necessários para confirmar sua eficácia em qPCR multiplex.
Objective: this study proposes the in silico design and validation of primers for multiplex quantitative PCR, aiming at rapidly detecting resistance genes. Methods: resistance gene sequences were obtained from NCBI and aligned using ClustalW to identify conserved regions. Primers and probes were designed with OligoArchitect™ Online and evaluated using IDT’s OligoAnalyzer to prevent secondary structures. Results: the blaSHV and ermA genes were selected as targets, with GAPDH as an internal control. Primers and probes showed structural variations, with differences in Tm and ΔG. Some sequences, such as ermA-F and ermA-R, had GC values near the lower limit, while blaSHV-R exhibited multiple hairpin formations. The multiplexing analysis revealed cross-interactions, with ΔG values ranging from -0.2 to -7.2 kcal/mol, indicating variable stability. Conclusion: the designed primers and probes exhibited appropriate GC content, Tm, and Gibbs free energy values, suggesting potential for molecular diagnosis. However, experimental tests are required to confirm their effectiveness in multiplex qPCR.
