SARS-CoV-2 genome RNA detection based on multiplex Real-Time RT-PCR assay

Ano: 2022 | Volume: 10 | Número: 1

Autores: Vânia de Avelar Lucas, Juliana Alves São Julião, Isabela Lemos de Lima, Thaise Gonçalves Araujo, Adriana Freitas Neves, Luiz Ricardo Goulart

Palavras-chave: COVID-19, fluorophores, one-step, one-tube, diagnosis.

Resumo Português:

Objetivos: Este trabalho objetivou o desenvolvimento de um ensaio de RT-PCR multiplex em tempo real para detectar o vírus SARS-CoV-2 em amostra biológica. Métodos: A RT-PCR multiplex em tempo real foi realizada em comparação com o protocol do CDC singleplex. Para a detecção das regiões virais N1 e N2 e do gene da RNase P humana, as sondas fluorescentes VIC-BHQ-1, FAM-BHQ-1 e TAMRA-BHQ-2, respectivamente, foram testados em uma reação triplex em um único tubo. Os swabs de 334 amostras de nasofaringe foram testados em comparações com o método singleplex, e um plasmídeo pUC18 foi construído com regiões concatenadas do nucleocapsídeo viral e do gene RNAse P como controle positivo. Resultados: Os dados pareados entre os dois ensaios apresentaram correlação positiva. Dados comparativos demonstraram que a reação multiplex foi eficiente apresentando 83% de concordância com o singleplex, e o RNA de SARS-CoV-2 foi detectado em 31 e 41%, respectivamente. Além disso, em 3% das amostras, o RNA viral foi detectado apenas no multiplex. Conclusões: Obteve-se um método rápido, específico e de menor custo comparado às reações singleplex para a detecção de SARS-CoV-2 e em um único tubo, destacando-se a escolha de fluoróforos convencionais no desenho de sondas, auxiliando na vigilância epidemiológica e no manejo clínico desta grave doença de saúde pública.

Resumo Inglês:

Objectives: This work aimed to develop a multiplex Real-Time RT-PCR assay to detect the SARS-CoV-2 virus in a biological sample. Methods: Multiplex Real-Time one-step RT-PCR was performed compared with the singleplex CDC protocol. For the detection of the N1 and N2 viral regions and host human RNase P gene, the fluorescent dyes VIC-BHQ-1, FAM-BHQ-1, and TAMRA-BHQ-2, respectively, were tested in a one-tube triplex reaction. The swabs from 334 nasopharyngeal samples were tested in comparisons with the singleplex method, and a pUC18 plasmid was constructed with concatenating regions from nucleocapsid and RNAse P gene as a positive control. Results: Paired data between the two assays presented a positive correlation. Comparative data demonstrated that the qRT-PCR multiplex was an efficient method presenting 83% of concordance with the singleplex, and the RNA from SARS-CoV-2 was detected in 31 and 41%, respectively. In addition, in 3% of the samples, the viral RNA was only detected in the multiplex. Conclusions: A fast, accurate, and low-cost method for detecting SARS-CoV-2 was obtained, highlighting the choice of conventional fluorophores and probes assisting in epidemiological surveillance and the clinical management of this serious public health disease.