INTRODUÇÃO: Na Região Amazônica, existe uma associação entre a ocorrência de surtos epidêmicos e as derrubadas de matas para construção de estradas ou implantação de novos povoados. Devido à maior variedade de espécies de vetores da leishmaniose e animais reservatórios nesta região, há um maior polimorfismo genético nos parasitas do gênero Leishmania. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi identificar as espécies de Leishmania isoladas de humanos em dois Municípios do Estado do Amazonas (Rio Preto da Eva e Manaus) e avaliar o polimorfismo genético destes parasitas. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram analisados 23 isolados por eletroforese de isoenzimas e o marcador de amplificação ao acaso de DNA polimórfico (RAPD). Para identificar as amostras, foram utilizados oito loci enzimáticos. Com base na similaridade das bandas e dos conhecidos loci diagnósticos, espécies foram atribuídas a cada estoque. A variabilidade interespecífica entre as amostras de flagelados foi determinada pelo RAPD. Os dados obtidos foram estudados por análise fenética e distância genética para determinar as relações taxonómicas entre as espécies/isolados deste gênero. RESULTADOS: Um total de cinco diferentes zimodemas foi encontrado e uma correlação entre os resultados das diversas técnicas numéricas e métodos foi demonstrada. Os zimodemas puderam agrupar duas espécies do subgênero Viannia - L. guyanensis e L. naiffi. Todos os isolados de L. guyanensis agruparam-se num mesmo zimodema e essas cepas foram polimórficas pela análise do RAPD, tal como L. naiffi. CONCLUSÃO: Os resultados demonstraram a aparente homogeneidade isoenzimática das amostras de L. guyanensis e a heterogeneidade de L. naiffi, indicando a circulação destas espécies em ambos os municípios. Foi possível observar, pelo RAPD, variabilidade genética entre as cepas isoladas de L. guyanensis e de L. naiffi. São discutidas as implicações e relações observadas entre os isolados, principalmente quanto à importância de escolha do marcador.